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Oui |
Bonne réponse. Oui C’est un bon choix. Le traitement à la phosphatase alcaline n’est pas essentiel à la suite de l’expérience, mais il vous permet d’épargner du temps car tous les plasmides coupés vont nécessairement se religuer avec un fragment d’ADN génomique. Par conséquent, il n’y aura (théoriquement) pas de vecteurs «vides». Toutes les bactéries transformantes, que vous récupérerez, auront un plasmide contenant un fragment d’ADN génomique. Si cela vous parait obscur, cliquez-ici pour voir un schéma explicatif. |
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Non |
Il ne vous est pas nécessaire de le faire, cependant le faire vous économisera beaucoup de temps. Une réaction par la phosphatase alcaline vous prendra environ 1h de travail. De regarder la couleur de toutes vos colonies de bactéries transformantes et de sélectionner les bons candidats (supposons des fragments de 10 kb en moyenne, il vous faudrait au minimum, si vous avez énormément de chance, 1'600 clones pour couvrir 1 fois le génome (16Mb/10Kb)) vous prendra BEAUCOUP plus de temps. Evidemment, vous pouvez estimer que, de toute façon, les plasmides vides n’interférant pas directement dans l’expérience, il n’est pas utile de les éliminer... mais, à terme, ce n’est certainement pas un bon calcul. Un traitement à la phosphatase alcaline peut donc se révéler très utile. Vers la bonne réponse. |
Votre vecteur est maintenant prêt à accueillir des fragments génomiques.
En résumé :
Vous avez choisi le vecteur le
plus approprié à la situation souhaitée, l'avez
coupé par une enzyme de restriction adéquate et l'avez
traîté à la phosphatase alcaline pour éviter
une future religation du vecteur sur lui-même.
Durant cette étape, vous allez couper l’ADN de Candida albicans après l’avoir extrait des cellules.
Il existe des kits commerciaux pour purifier efficacement de l’ADN à partir de presque tous les types cellulaires. Afin d’obtenir un bon rendement, vous privilégez l’un de ces kits (procédure en illustration) plutôt qu’une méthode moins coûteuse mais moins efficace (Pour obtenir de l’ADN génomique, il suffit de casser les cellules en les broyant en présence d’un détergeant. L’ADN est ensuite séparé des débris cellulaires par centrifugation, puis précipité avec de l’éthanol 70%).
A partir d’une simple culture de cellules dans un milieu nutritif liquide (contenant environ 107 cellules), vous récupérez l’ADN génomique de C. albicans, à l’aide d’un kit commercial. Vous disposez désormais de quelques centaines de microgrammes d’ADN, principalement sous forme de fragments de 50 à 150kb (Rappelez-vous que la taille moyenne d’un chromosome de C. albicans est de 2 Mégabases).
Pour établir votre banque génomique, il vous faut couper ces morceaux de chromosomes en petits fragments afin qu’ils puissent être insérés dans votre vecteur et soient amplifiés par les bactéries. Vous avez coupé votre vecteur par BamHI, une enzyme reconnaissant un site de restriction formé de 6 paires de bases. Plusieurs choix s’offrent à vous pour préparer vos fragments : (cliquez sur l'image de votre choix)
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Faire une digestion complète par BamHI |
Faire une digestion partielle par BamHI |
Faire une digestion partielle par Sau3A (cette enzyme reconnaît une séquence de 4pb, et génère des bouts compatibles avec ceux de BamHI) |
Pour vous aider dans votre choix, souvenez-vous que vous disposez de plusieurs copies complètes du génome de C. albicans. Vous souhaitez des fragments d’ADN entre 4 et 12 kb (souvenez-vous du nombre de gènes inclus, en moyenne, dans un fragment de 8kb ?). Vaut-il mieux avoir des fragments identiques pour chaque copie de génome, ou différents (et donc chevauchants) ?
B. Emery. 21.11.05
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