Choix de l'enzyme

Bonne réponse. BamHI

Cette enzyme est certainement votre meilleur choix. BamHI génère théoriquement des fragments d’environ 4kb (46 = 4096). La taille moyenne d’un gène est de 2.3Kb et il y a théoriquement 1 gène tous les 2.5 Kb (16'000/6'500). En coupant partiellement (1 site sur 2) avec BamHI, vous devriez pouvoir générer des fragments de 8kb contenant environ 3 gènes. Notez que pour tous ces chiffres, il s’agit toujours de moyennes et de fréquences théoriques. La réalité peut être très différente.

Le fait que BamHI génère des bouts cohésifs est important pour la ligation. En effet, des bouts francs sont plus difficiles à liguer !

 

 

Mauvaise réponse. SmaI

Pas mal, mais on peut faire mieux. SmaI génère des bouts francs, ceux-ci sont plus difficiles à liguer (pourquoi ?), ce qui pour l’établissement d’une banque d’ADN génomique, n’est pas idéal. Cependant, l’arrivé de certains kits commerciaux augmente beaucoup l’efficacité de ce type de ligation (et les rend presque aussi efficace que celles à bout cohésifs)... alors rien n’est perdu. Le meilleur choix était BamHI.

 

 

Mauvaise réponse. NotI

Bof, c’est pas gagné (mais ce n’est pas encore perdu, nous avons commencé par couper le vecteur et pas l’ADN génomique). Théoriquement, NotI génère des fragments d’environ 65Kb (48=65'536). Un gène moyen de C. albicans représente 2.3Kb et il y a un gène tous les 2.5kb (16’000/6'500), dans 65Kb, il y a donc 26 gènes. Le problème est qu’un plasmide de 65Kb ne peut pas être répliqué dans une bactérie (la taille maximale étant d’environ 15 kb)... il n’y aurait donc pas d’amplification (sans oublier qu’il serait tout aussi difficile de le faire rentrer dans les cellules de C. albicans).

Heureusement, NotI génère des fragments compatibles avec ceux de EagI, une enzyme de restriction qui reconnaît 6pb. Le meilleur choix était BamHI.

 

 

Maintenant que votre vecteur est coupé, il vous faut encore penser à la future ligation avec les fragments d’ADN génomique.

La ligation nécessite un phosphate 5’ sur le brin du premier fragment à liguer et un 3’ OH sur l’autre fragment (et cela respectivement sur l’autre brin, voir image), ainsi que de l’ATP pour fournir l’énergie nécessaire à l’enzyme de ligation (ligase).

Un commercial d’une société de biotechnologie, qui passait justement par votre labo (pour vous donner son catalogue), vous dit qu’il dispose d'une enzyme miracle qui s’appelle la phosphatase alcaline (AP). D'après lui, l'enzyme empêchera le vecteur de se religuer sur lui-même. Il vous explique que la phosphatase alcaline enlève le phosphate à l’extrémité de l’ADN et empêche ainsi sa ligation. Méfiant vous demandez plus de précisions. Il vous dit que seul le vecteur doit être traité avec la phosphatase alcaline, sinon il n’y aurait aucune ligation possible avec vos fragments (Dans ce cas, pourquoi y a-t-il tout de même ligation avec un vecteur traité et un fragment non-traité ?).

Vous réfléchissez un moment et vous vous dites que finalement, pour faire la différence entre un plasmide ayant intégré un fragment et un plasmide ne l’ayant pas fait, vous avez le système lacZ (comment ça marche ?). Du coup, est-il utile de traiter le vecteur à la phosphatase alcaline ?

 

Oui

Non

 

B. Emery. 21.11.05