TD4 : Electrophorèse

Expérience 2 : Gel 2D d’extraits protéiques de biofilm de Streptococcus mutans.

Avant-propos: Consignes

Cette expérience virtuelle se déroule de manière similaire à la première :

• Vous disposez de 15 minutes pour réaliser l’expérience. Ne perdez pas trop de temps.
• Lisez attentivement la description de l’expérience.
• Lorsqu’on vous demandera de choisir, réfléchissez et cliquez sur la réponse qui vous paraît la plus logique.

• Si vous avez le temps, réfléchissez aux questions posées en italique.

• Les questions en rouge seront discutées durant la synthèse de l’expérience.
• Si vous ne terminez pas l'expérience dans le temps imparti, vous pourrez la refaire plus tard. L'adresse web de l'expérience est en lien sur Dokeos.
• Vous pourrez toujours m'adresser vos remarques par email : Bertrand.Emery@romandie.com.

Cette expérience virtuelle est inspirée de véritables expériences. Cependant, afin de rendre le TD plus intéressant et de favoriser les questions, des adaptations ont été effectuées (dont certaines sont peu probables).

Article ayant inspiré cette expérience : Welin et al. Effect of acid shock on protein expression by biofilm cells of S. mutans. FEMS microbiology letters. 2003

Introduction :

Convention : 1 kDa (kilo Dalton) = 1'000 Da (Dalton, unité de mesure de masse moléculaire). pI = point Isoélectrique, il correspond au pH pour lequel une protéine est globalement « neutre » (autant de charges + que de charges –).

Streptococcus mutans :

Streptococcus mutans est une bactérie de type « coque à Gram + », présente notamment dans la région buccale et en particulier sur la plaque dentaire, où elle forme des biofilms et acidifie son environnement (ce qui détruit l’émail des dents et provoque les caries). S. mutans est anaérobe et aérotolérante (quelle différence ?), elle se présente en général en petite chaîne de coques. En tant qu’anaérobe, elle produit son énergie à partir de la dégradation du glucose en acide lactique (voyez-vous un lien avec la formation de caries ?)

Le génome de S. mutans représente 2Mb, entièrement séquencé en 2002 (lien ; lien), et contient environ 2000 gènes.

Le temps de génération (doublement) de S. mutans est de 7h, dans les conditions utilisées pour cette expérience (et donc très loin des 20min. de E. coli, utilisée dans le TD2).

Plus d’informations sur les streptocoques : http://membres.lycos.fr/neb5000/BacteriologieI/Groupes%20Bacteriens/Coques%20Gram-positifs.htm
Plus d’informations sur la formation de caries : http://www.caobisco.com/french/pdf/Caries.pdf

Le Protéome :

Il y a deux approches majeures de l’étude des organismes, l’une génétique (à partir des gènes) et l’autre protéique (à partir des protéines). L’ensemble des gènes d’un organisme représente son génome. De manière similaire, l’ensemble des protéines contenues dans une cellule à un moment donné, représente son protéome. Il y a donc plusieurs protéomes pour chaque organisme, car celui-ci varie en fonction de l’activité de la cellule et de son environnement. On trouve des protéomes sur internet, notamment sous forme de gels 2D colorés (lien).

En résumé, le génome vous donnera une information sur les possibilités d’une cellule, alors que son protéome vous donnera sa composition exacte à un moment très précis.

Le marquage radioactif des protéines :

Il existe plusieurs moyens de marquer des protéines. L’incorporation d’éléments radioactifs durant la synthèse des protéines par l’organisme étudié, permet de marquer spécifiquement les protéines nouvellement synthétisées. En effet, si vous utilisez une coloration non spécifique, vous détecterez toutes les protéines, «anciennes et nouvelles». Dans certains cas, il peut être intéressant de ne marquer que les «nouvelles» protéines. Il existe deux isotopes radioactifs couramment utilisés pour marquer les protéines : ¹⁴C et ³⁵S. En général, on fabrique des acides aminés contenant l’un des deux isotopes, que l’on place ensuite dans le milieu de cultures des bactéries. Ces dernières les incorporent alors dans leurs protéines nouvellement synthétisées. Un autre avantage de l’utilisation de la radioactivité c’est qu’il n’est pas nécessaire d’utiliser une méthode de coloration pour « visualiser les protéines marquées ». En effet, la fission des isotopes radioactifs émet des rayonnements suffisants à impressionner un film photographique. Si cela ne vous semble pas clair, un schéma explicatif sera donné durant la synthèse de l'expérience.

Question : Voyez-vous une différence stratégique entre l’utilisation du ¹⁴C et celle du ³⁵S ? Sachant qu’il n’y a pas de grandes différences d’intensité de radiations produites par ces deux isotopes.

Expérience 2

Cliquez-ici pour afficher le schéma de l'expérience.

Etape 1 : Marquage des protéines

La première étape consiste à marquer les protéines avec l’isotope radioactif. Pour cela, nous utilisons une méthode dite de « pulse », où des nutriments radioactifs sont donnés aux cellules pendant un certain temps.

Nous effectuons 2 cultures de S. mutans, la première favorisant une croissance dite planctonique alors que la seconde favorise la création de biofilms. Pour chacun de ces systèmes, nous effectuons une culture à pH 7.5 et une autre à 5.5. Vous disposez donc de 4 cultures différentes. (pourquoi en faire autant ?).

Les cellules sont donc incubées en présence d’acides aminés marqués radioactivement (quelles mesures de protection devez-vous prendre ?) par du ¹⁴C pendant 2 heures (c’est le « pulse »). Après ce marquage, les cellules sont récupérées et lysées par ultrasonication (les cellules sont soumises à un traitement aux ultrasons qui cassent leur paroi, et un détergent dissout leur membrane). Les protéines sont alors récupérées pour la suite de l’expérience.

Après la lyse, avez-vous des protéines non-marquées radioactivement, et si oui, devez-vous les éliminer avant de poursuivre votre expérience ? (choisissez la bonne illustration)

B. Emery. 24.11.05