Mesures de protections

Bonne réponse. Gants et lunettes de protection.

Evidemment, un équipement de protection adéquat vous est indispensable, sans quoi vous risquez : un cancer (à cause du bromure d’Ethidium ; portez donc des gants et une blouse de protection) et de devenir aveugle ou de développer un cancer de la peau (à cause des UV ; portez donc des lunettes de protection, une blouse et des gants).

 

 

Mauvaise réponse. Aucun équipement de protection.

Aïe… heureusement que ce n’est qu’une expérience virtuelle, sans quoi vous auriez mis votre vie en danger. Le bon choix était le n° 4, allez tout de suite comprendre pourquoi !

 

 

Mauvaise réponse. Gants et compteur Geiger.

On limite les dégâts... mais ce n’est clairement pas un bon choix. Un compteur Geiger vous permet de détecteur les rayons gamma, et non les rayons UV (voir le spectre des rayonnements), il vous est donc inutile. Les gants vous protègent contre le bromure d’Ethidium et les UV, mais seulement sur vos mains. Vos yeux ne sont pas protégés des UV. La bonne réponse était la n°4.

 

 

Mauvaise réponse. Lunettes de protection.

Votre protection est un peu légère vous ne trouvez pas ? Certes vos yeux ne seront pas abîmés par les rayons UV, mais vos mains alors ? Le Bromure d’Ethidium est une substance toxique. Pensez-vous vraiment réussir à tous les coups sans vous salir les mains ? C’est un pari risqué non ? La bonne réponse était la n° 4.

 

Question : Pensez-vous que ce type de visualisation (EtBr et UV) peut causer du tort à votre expérience ? Pourquoi, comment ?

 

 

Pour extraire vos fragments d'ADN, du petit morceau de gel que vous venez de couper, vous allez utiliser un kit commercial. A nouveau plus efficace que les bonnes vieilles méthodes, mais plus cher. En résumé, la méthode consiste à faire fondre le gel d’agarose (à maximum 50°C, pourquoi ?) et de récupérer votre ADN grâce à une colonne échangeuse d’ions.

Vous avez désormais vos fragments d’ADN, de bonne taille et représentant plusieurs fois le génome complet de Candida albicans (avec des fragments différents). Vous allez pouvoir enfin terminer la construction de votre banque.

 

 

Quatrième étape : Ligation et amplification dans les bactéries.

Autant le dire tout de suite, l’étape la plus facile (enfin en théorie, car en pratique, ce n’est pas toujours aussi évident).

A l’aide d’une «colle moléculaire à ADN», nommée l’enzyme ligase, vous allez coller vos fragments d’ADN génomique dans votre vecteur. Le traitement du vecteur à la phosphatase alcaline empêchera celui-ci de se refermer sur lui-même et optimisera, par conséquent, votre rendement. (Retour vers la discussion sur l'AP)

Vous mélangez donc votre vecteur avec vos fragments, ajoutez la ligase et de l’ATP (pourquoi ?). Vous incubez votre tube de réaction pendant 1 heure à 37°C. Votre banque génomique est enfin prête... enfin pas tout à fait. Certes, vous avez des vecteurs avec des inserts, mais vous n’avez que peu de matériel (en cas de problème avec la suite de l’expérience, il vous faudra tout recommencer). Vous décidez donc d’amplifier vos plasmides en transformant des bactéries.

Vous transformez une souche d'E. coli avec le résultat de votre ligation, par électroporation (ou électro-transformation): les bactéries sont soumises à un bref choc électrique, ce qui ouvre des pores membranaires et permet à l’ADN d’entrer dans les bactéries. Malheureusement, toutes les bactéries n’ont pas été transformées par la manoeuvre (en fait, une grande majorité ne l’est pas).

Questions : Comment allez-vous faire la différence entre une bactérie ayant reçu un plasmide avec un fragment d’une bactérie n’ayant rien reçu, ou ayant reçu un plasmide/fragment linéarisé (non ligué) ? Pourquoi ne pas réaliser plutôt l’amplification d’ADN par PCR, comme dans le TD 3 ?

Après sélection des bactéries transformées, il ne vous reste plus qu’à en extraire les plasmides amplifiés. A nouveau, l’emploi d’un kit commercial rend la manœuvre rapide et efficace (mais plus chère). La méthode est similaire à la purification d’ADN génomique de C. albicans (revoir l'illustration), excepté que la lyse des cellules est plus faible afin d’éviter de récupérer le chromosome d’E. coli.

Questions : est-ce que toutes les bactéries transformées portent le même plasmide avec le même fragment ? Si non, vous est-il utile de trier chaque clone séparément, plutôt que de cultiver vos bactéries toutes ensemble ?

 

 

FIN de la première expérience

Vers les méthodes de séparations des molécules (Synthèse)

Vers la seconde expérience

 

B. Emery. 21.11.05