TD4 : Electrophorèse

Expérience 1 : Construction d'une banque d’ADN génomique de Candida albicans.

But de l’expérience :

Afin de créer une banque de mutations par insertion (d'un marqueur), vous devez commencer par construire une banque d’ADN génomique. La banque d'insertion sera utilisée pour trouver des gènes impliqués dans la formation de biofilm chez Candida albicans. Ce champignon opportuniste est fréquemment rencontré chez les malades immunosupprimés (p.ex. SIDA), où il envahit les muqueuses et cause des Candidoses (photo). Cependant, la colonisation de surfaces (et la formation d’un biofilm), comme celle des cathéters vasculaires, est également un problème important en médecine (infections nosocomiales), car pouvant causer des candidoses «disséminées» (pouvant causer de graves lésions à potentiellement tous les organes internes).

Candidose linguale (Muguet).
(www.atlas-dermato.org/atlas/candidico.htm)

Question : Pourquoi créer une banque d’insertion pour trouver des mutants plutôt que réaliser une mutagenèse aléatoire par UV (comme dans le TD 2)? Quels sont les inconvénients que peut présenter une banque d’insertion ?

Avant-propos: Consignes :

Besoin de révisions ? C'est par ici : Introduction
Vous disposez de 25 minutes pour réaliser l’expérience. Ne perdez pas trop de temps.
Lisez attentivement la description de l’expérience. Lorsqu’on vous demandera de faire un choix, réfléchissez et cliquez sur la réponse qui vous paraît la plus logique.
Même si vous avez répondu correctement, pensez à lire les autres choix.
Les réponses aux questions en italique figurent généralement sur une autre page html (cliquez sur la question). Ne vous attardez pas sur ces questions.
Les questions en rouge seront discutées durant la synthèse de l’expérience.
Si vous ne terminez pas l'expérience dans le temps imparti, vous pourrez la refaire plus tard. L'adresse web de l'expérience est en lien sur Dokeos.
Vous pourrez toujours m'adresser vos remarques par email : Bertrand.Emery@romandie.com.

Cette expérience virtuelle est inspirée par de véritables expériences, cependant, afin de rendre le TD plus intéressant et favoriser les questions, des adaptations ont été effectuées (dont certaines sont peu probables).

Articles ayant inspiré cette expérience : Richard et al. Candida albicans Biofilm-defective mutants. Euk. Cell, 2005. Davis et al. C. albicans Mds3p, a conserved regulator of pH responses and virulence identified through insertional mutagenesis. Genetics 2002

Introduction :

Convention : 1Mb {méga (paires de) bases} = 1'000 kb {kilo (paire de) bases} = 1'000'000 pb {paire de bases}. Il s’agit ici d’un moyen de quantifier la taille de molécules d’ADN, en nucléotides appariés. Chaque acide aminé (aa) est codé (sur l’ADN/ARN) par un groupe de 3 nucléotides (=codon). Un ORF (=cadre de lecture ouvert ; partie du gène codant pour la protéine) mesurant ~1kb code donc pour une protéine de ~332 aa (pourquoi pas 333 ?).

Candida albicans :

Candida albicans est un champignon unicellulaire (eucaryote inférieur) diploïde, croissant sous forme unicellulaire et d’hyphe (filaments de cellules reliées entre-elles). Le biofilm formé par C. albicans est composé de cellules unicellulaires, pseudohyphales, voire d’hyphe, et d’une matrice extracellulaire composée de polysaccharides et de protéines. Ce biofilm protège notamment C. albicans contre les antifongiques. La formation du biofilm s’effectue en trois étapes : des colonies unicellulaires commencent par se former; ensuite les cellules adoptent une conformation pseudohyphale et produisent une matrice extracellulaire. Finalement, matrice et filaments (hyphe) grandissent de concert.

Son génome représente 16 Mb (haploïde) pour ~6500 gènes (dont 200 env. contiennent des introns ; taille moyenne des ORF : ~1.5kb ; lien) répartis sur 8 paires de chromosomes homologues ; il a été entièrement séquencé en 1998 (lien ; lien). Les analyses génétiques de Candida albicans sont difficiles car ce champignon grandit sous forme diploïde asexuée (Pourquoi cela pose-t-il un problème ?).

Forme planctonique

Forme pseudohyphale

Forme hyphale

Plus d’info sur Candida albicans : http://www.pasteur.fr/recherche/unites/RIF//lie.html
Plus d’info sur les candidoses : http://www.cnrs.fr/SDV/Dept/candidose.pdf ; http://www.med.univ-rennes1.fr/cgi-bin/iw/fichiers_de_codeadm.pl?code=M01219

Banque génomique :

Une banque génomique est une collection de plasmides, dont chacun contient un morceau de chromosome provenant de l’organisme que l’on souhaite étudier. Une banque génomique idéale couvre 10 fois le génome complet, avec des fragments « chevauchant » et de différentes longueurs. Une banque génomique peut servir de support pour séquencer le génome de cet organisme, de banque de complémentation afin d’identifier des mutants récessifs (p.ex dans l’expérience du TD2), ou pour la création d’une banque d’insertion (inactivation de gène par insertion d’un marqueur).

Questions : Pourquoi est-il important de couvrir plus d’une fois le génome ? Quel est l’intérêt d’avoir des fragments chevauchants ?

Banque d’insertion :

Il y a plusieurs façons de créer une banque d’insertion, mais cela n’étant pas le sujet de ce TD, nous ne verrons que celle utilisée dans les articles cités (et sur lesquels se base cette petite expérience). A partir d’une banque génomique, des insertions par un transposon (qui inclut un marqueur de sélection) sont réalisées in vitro dans les fragments chromosomiques de la banque. Après amplification de la banque (par des bactéries), les fragments seront excisés des vecteurs et utilisés pour transformer des cellules de Candida albicans (création d’une collection de cellules mutantes par insertion ; par recombinaison, les insertions remplaceront les copies chromosomiques). Chaque transformant sera alors étudié pour découvrir le phénotype recherché. Le locus de l’insertion sera alors identifié par séquençage.

Question : Voyez vous d’autres moyens de procéder pour fabriquer une collection de mutations par insertion ?

Expérience 1

Cliquez-ici pour afficher le schéma de l'expérience.

Première étape : Préparation du vecteur.

Durant cette étape, vous allez choisir un vecteur et une enzyme de restriction pour couper votre vecteur (qui recevra les fragments de chromosomes de Candida albicans).

Pour construire votre banque deux vecteurs s’offrent à vous : (cliquez sur la bonne image)

pBA01 (nom fictif), un plasmide (dérivé de pUC19) disposant d’une origine de réplication bactérienne «high copy» (dans une bactérie, il y aura entre 75 et >200 copies du vecteur selon la température), d’un gène bactérien de résistance à un antibiotique et, d’un site de clonage (contenant plusieurs sites de restriction) inséré dans l’ORF du gène rapporteur lacZ.

pEU01 (nom fictif), un plasmide disposant d’une origine de réplication bactérienne «low copy» (dans une bactérie, il y aura entre 5 et 10 copies du vecteur), d’un gène bactérien de résistance à un antibiotique, mais également d’une origine de réplication eucaryotique (de S. cerevisiae, mais qui fonctionne également chez C. albicans) et, d’un site de clonage (contenant plusieurs sites de restriction) inséré dans l’ORF du gène rapporteur lacZ.

En vous aidant des informations données sur la construction de la banque d’insertion dans la partie Introduction et des quelques questions qui suivent, choisissez le vecteur que vous allez utiliser pour construire votre banque génomique.

Questions à se poser : Allez-vous transformer votre vecteur dans les bactéries ET/OU Candida albicans. Avez vous besoin d’une bonne amplification par les bactéries de votre vecteur (high copy) ou non (low copy).

B. Emery. 5.11.08 - mise à jour des liens