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Bonne réponse. pBA01.
Effectivement, c’est le meilleur choix possible pour la
construction de votre banque. Vous avez besoin d’une bonne
amplification de votre vecteur dans les bactéries pour
effectuer vos insertions, car une grande quantité de
matériel est nécessaire pour vous assurer
d’effectuer une insertion dans le grande majorité
des ORF de votre banque.
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Mauvaise réponse. pEU01
L’expérience marchera, mais ce n’est pas le
meilleur choix possible. En effet, lors de la construction de
votre banque d’insertion, il est primordial de privilégier
l’amplification dans les bactéries pour avoir une
grande quantité de fragments à transformer dans
Candida albicans. L’origine de réplication de
Candida albicans ne vous sert à rien car vous ne
transformerez que le fragment génomique (et pas le vecteur
complet), dans le but de remplacer la copie chromosomique par
votre insertion. Vers la bonne réponse.
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Question : si vous désirez
construire une banque génomique afin d’effectuer une
complémentation (d’un mutant récessif inconnu),
auriez-vous fait le même choix ?
Maintenant que vous avez votre vecteur, il vous faut choisir les
enzymes de restriction que vous allez utiliser :
Votre vecteur dispose de nombreux sites de restriction. A nouveau,
plusieurs choix sont possibles. N’oubliez pas qu’il vous
faudra également couper votre ADN génomique par la
suite et, pour effectuer une ligation, il vous faudra des extrémités
«compatibles» : (cliquez sur l'image de votre choix)
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SmaI (reconnaît une séquence de
6 pb et génère des bouts «francs»)
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BamHI (reconnaît une séquence de
6 pb et génère des bouts cohésifs)
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NotI (reconnaît une séquence de
8pb et génère des bouts cohésifs)
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Pour vous aider, tentez de répondre à ces
questions/réflexions :
Questions : Quelle est la grandeur théorique moyenne des
fragments d’ADN génomique générés
par une digestion par ces enzymes ? Mettez cette donnée en
relation avec la taille moyenne d’un gène de C. albicans
(ORF = 1.5kb, donc ~2.3kb avec promoteur et terminateur ; génome
complet 16Mb pour ~6'500 gènes). Pensez également au
fait que vous n’avez pas l’obligation de couper tous les
sites de restriction (-> digestion partielle). Imaginez l’impact
que peut avoir la génération de fragments de
restriction avec des extrémités cohésives ou
franches (meilleure ou moins bonne ligation ?)
B. Emery. 21.11.05